O básico sobre como fazer um DNA no laboratório
Muita gente pergunta como fazer um dna e começa pela resposta errada. Não dá pra "fazer" DNA do nada sem ter uma matriz. O que se faz é extrair, amplificar ou sintetizar. Cada coisa tem seu caminho, e misturar os procedimentos é o jeito mais rápido de perder reagentes caros e uma semana de trabalho. A pergunta mais comum que eu vejo é sobre extração de DNA de amostras biológicas, então vou começar por aí. Depois explico amplificação e síntese.
Como fazer um dna por extração caseira com material acessível
Se você está falando de um procedimento didático ou de Emergência, o protocolo de lavagem de alho ou morango funciona. Eu já vi isso ser feito em salas de aula com resultados surpreendentemente bons para visualização grossa do material genético. O protocolo é mais ou menos isso:
Amasse a amostra vegetal. Use alho, morango ou bananas. A quantidade não precisa ser precisa. O importante é triturar bem. Adicione solução de extração. Água morna, sal e detergente neutro. O detergente quebra a membrana lipídica das células. O sal ajuda a estabilizar o DNA. A proporção prática que eu uso é uma pitada de sal para cada colher de detergente, dissolvido em água morna.
Filtre. Use coador de pano ou filtro de café. O líquido que passa contém as células rompidas e o material genético solto. Adicione álcool etílico gelado. O DNA não se dissolve em álcool. Ele precipita. Despeje o álcool devagar pela lateral do recipiente para criar uma camada separada. O DNA aparece como fios esbranquiçados na interface entre as duas camadas.
O problema que eu sempre Encontro com esse método é que o DNA vem sujo. Vem misturado com proteínas, RNA e restos celulares. Para uso educacional, isso não importa. Para qualquer coisa que exija purificação, esse protocolo é inútil.
Como fazer um dna por extração laboratorial padrão
No laboratório, o protocolo clássico de fenol-clorofórmio ainda é válido, mas a maioria das pessoas usa colunas de sílica. É mais rápido e evita exposição a reagentes tóxicos. Com colunas de lise, o processo leva cerca de 30 minutos. Você lisifica a amostra com proteína K e buffer de lise. A coluna captura o DNA. Dois ou três lavagens com buffer de lavado. Eluição em água ou buffer TE. O rendimento varia conforme a amostra. Sangue total rende cerca de 2 a 5 microgramas por mililitro. Tecido é variável. Amostras forenses antigas podem render nanogramas.
A armadilha comum é não verificar a pureza. Absorbância em 260 nanômetros dividida por 280 nanômetros deve dar algo entre 1,8 e 2,0. Se estiver abaixo disso, tem proteína ou fenol residual. Se estiver acima, pode ter RNA contaminante. A correção é simples: refazer a lavagem ou adicionar RNase A durante a lise.
Como fazer um dna por PCR após a extração
Extraído o DNA, o próximo passo natural é amplificar a região de interesse. PCR é o nome. Primeiro você precisa de primers. Primers são oligonucleotídeos de 18 a 25 pares de bases desenhados para flanquear a região que você quer amplificar. Eu costumava desenhar primers manualmente antes de ferramentas online existirem. Agora uso programas como Primer3 ou o NCBI Primer-BLAST. A regra prática: temperatura de anelamento entre 55 e 65 graus Celsius, tamanho do produto entre 200 e 500 pares de bases para a maioria das aplicações rotineiras.
Ciclo padrão de PCR: Denaturação a 94 graus por 30 segundos.
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Anelamento conforme a Tm dos primers, cerca de 30 segundos. Extensão a 72 graus, cerca de 1 minuto por mil pares de bases.
De 25 a 35 ciclos. Finalização a 72 graus por 5 a 10 minutos.
O erro mais frequente que eu vejo em quem está começando é usar muito molde de DNA. Mais não é melhor. Entre 10 e 100 nanogramas geralmente funciona. Acima disso, inibidores presentes na preparação podem atrapalhar a Taq polimerase. Também preste atenção no MgCl2. A concentração de magnésio afeta diretamente a especificidade e o rendimento. A maioria dos kits já vem com a concentração otimizada, mas se você prepara seu próprio reagente, testar entre 1,5 e 2,5 mM faz diferença.
Como fazer um dna por síntese química (oligonucleotídeos)
Se a pergunta for sobre sintetizar uma sequência nova do zero, sem usar biológico, o caminho é síntese química em fase sólida. Isso é feito em equipamentos chamados sintetizadores de oligonucleotídeos. Empresas como Integrated DNA Technologies, Eurofins e others fazem isso por encomenda. O processo usa fosforamiditos. Cada ciclo adiciona um nucleotídeo. O rendimento por ciclo é cerca de 98,5 por cento. Para um oligo de 100 bases, isso significa um rendimento teórico de cerca de 22 por cento. Por isso oligos muito longos têm problemas de pureza e custo sobe rapidamente.
Se você precisa de um gene inteiro, não compra um oligo único. Compra fragmentos menores e monta por Golden Gate, Gibson assembly ou PCR de sobreposição. A montagem por Gibson é provavelmente o método mais prático hoje. Você marca extremidades sobrepostas de 20 a 40 pares de bases entre os fragmentos, mistura com a mix de enzimas, e em uma única reação a 50 graus por 15 a 60 minutos, os fragmentos são justapostos e religados.
Problema real que eu já enfrentei
Num projeto meu, estávamos cloneando um fragmento de 3,2 kilobases em um vetor de expressão. O PCR funcionou. A restrição também. Mas a ligação não pegava. Tentamos três vetores diferentes, três enzimas de restrição distintas, várias concentrações de T4 ligase. Nada. O problema era metilação. O inserto vinha de um DNA genômico extraído de um tecido que continha sequences repetitivas sensíveis à metilação. A enzima de restrição que estávamos usando não cortava regiões metiladas. A solução foi usar uma linhagem bacteriana isoparental que não metila o DNA, ou simplesmente trocar a enzima por uma que não é sensível à metilação naqueles sítios específicos. Ganhámos um dia de trabalho e economizamos reagentes.
O que funciona e o que não funciona
Extração por colunas: funciona bem para a maioria das amostras comuns. Falha com amostras rica em polisacarídeos, como plantas com tecidos mucilaginosos. Nesses casos, o protocolo de CTAB ainda é a melhor opção. PCR direto de amostras brutos: às vezes funciona, mas a pureza do DNA extraído interfere na eficiência. Amostras com hemoglobina residual ou restos de detergentes inibem a polimerase.
Síntese de genes longos: possível, mas cara. Sequências acima de 3 kilobases tendem a acumular erros de síntese. Para genes maiores, a estratégia de síntese em fragmentos e montagem subsequente é mais confiável.
O que você precisa decidir antes de começar
Antes de qualquer procedimento, defina claramente o objetivo. Você quer apenas visualizar o DNA? Usa extração simples. Precisa amplificar um gene específico? Vai de PCR. Quer uma sequência que não existe naturalmente? Síntese química com montagem. Definir o objetivo economiza tempo e dinheiro. A maioria dos erros acontece porque a pessoa começa pelo passo errado, achando que um método resolve tudo.
